及時解決狗肝微粒體問題是保障體外代謝數據可靠性的關鍵

更新時間：2026-01-23

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　　狗肝微粒體作為藥物代謝研究的重要體外工具，廣泛應用于代謝穩定性評估、種屬差異分析及藥物相互作用（DDI）預測。在實際操作中，可能會因樣本質量、實驗設計或操作細節問題，導致代謝活性偏低、數據重復性差、酶失活或結果不可比等現象，影響研發決策?？茖W識別并解決狗肝微粒體的這些問題，是保障體外代謝數據可靠性的關鍵。

　　一、代謝反應速率異常低或無轉化

　　原因：微粒體失活、NADPH再生系統失效、孵育溫度/時間不足或底物溶解度差。

　　解決方法：

　　確認微粒體儲存條件（–80℃凍存，避免反復凍融），使用前冰上解凍；

　　新鮮配制NADPH再生液（含NADP、葡萄糖-6-磷酸、G6PDH），或使用商業穩定型試劑盒；

　　嚴格控制孵育條件：37℃水浴、充分振蕩（如300rpm）、時間通常30–60分鐘；

　　對難溶化合物，使用助溶劑（如乙腈≤1%），并設溶劑對照組。

　　二、實驗重復性差（RSD＞15%）

　　原因：加樣誤差、微粒體濃度不均、移液器未校準或反應終止不及時。

　　解決方法：

　　使用多通道移液器或自動化工作站減少人為誤差；

　　微粒體使用前充分混勻（輕柔渦旋，避免起泡）；

　　校準移液器，尤其在10–100μL小體積操作時；

　　到時立即加入冰冷乙腈或甲醇終止反應，快速離心去除蛋白。

　　三、陰性對照出現代謝產物

　　原因：未加NADPH的對照組被污染、微粒體自身含Ⅱ相酶活性或非酶降解。

　　解決方法：

　　設置完整對照組：空白（無微粒體）、無NADPH、熱滅活微粒體（95℃,10min）；

　　若涉及葡萄糖醛酸化等Ⅱ相反應，需額外添加UDPGA輔因子，并區分Ⅰ/Ⅱ相貢獻；

　　驗證化合物在緩沖液中是否自發水解（如酯類）。

　　四、批次間結果不一致

　　原因：不同供體來源微粒體酶表達差異大，未使用混合池。

　　解決方法：

　　優先選用多只犬肝臟混合制備的商業化微粒體產品，提高代表性；

　　記錄每批微粒體的蛋白濃度與CYP酶活性（如睪酮6β-羥基化活性）；

　　關鍵項目使用同一批次微粒體完成全部測試。